Medicina de Precisão e Liquid Biopsy: ctDNA, Células Tumorais Circulantes e Biomarcadores Moleculares

# Medicina de Precisão e Liquid Biopsy: ctDNA, CTCs e Biomarcadores Moleculares

A biópsia líquida (liquid biopsy) é a detecção e análise de material tumoral liberado na circulação sanguínea — um "retrato molecular" do tumor acessível por simples coleta de sangue periférico, sem necessidade de biópsia tecidual invasiva. Os componentes principais da biópsia líquida incluem:

• ctDNA (circulating tumor DNA): Fragmentos de DNA livre plasmático (cfDNA) originados de células tumorais necróticas ou apoptóticas
• CTCs (circulating tumor cells): Células tumorais intactas que se destacam do tumor primário/metástase e circulam no sangue
• Exossomos/Vesículas extracelulares tumorais: Vesículas de membrana (50-150 nm) secretadas ativamente por células tumorais contendo RNA, proteínas e DNA
• Proteínas/Peptídeos tumorais circulantes: Marcadores como CEA, PSA, CA-125 já utilizados clinicamente

Biologia do cfDNA e ctDNA

O cfDNA (cell-free DNA) é DNA de dupla fita liberado na circulação por processo de apoptose fisiológica (fragmentação nucleossomal em fragmentos de ~167 pb = 1 nucleossomo + linker) e necrose (fragmentos > 10 kb). Em adultos saudáveis: 1-20 ng/mL de cfDNA no plasma. O ctDNA representa a fração do cfDNA de origem tumoral — tipicamente 0,01-10% do cfDNA total (variável com estadiamento, vascularização e cinética de morte tumoral).

Mecanismo de liberação: Células tumorais morrem por apoptose (cascatas de caspases → DNAse I intracelular → fragmentação nucleossomal) ou necrose → DNA liberado para o espaço intersticial → drena para capilares linfáticos → circulação. Semivida do ctDNA: ~1-2 horas (eliminado por nucleases plasmáticas, rins e fígado) → reflete dinâmica tumoral em tempo real.

Características do ctDNA:

• Leva mutações somáticas do tumor (SNVs, indels, CNVs, fusões) identificáveis por sequenciamento
• Padrões de fragmentação (fragmentomics): ctDNA tem tamanho médio ligeiramente menor que cfDNA germline (~166 vs. ~167 pb); perfil de posicionamento nucleossomal reflete abertura/fechamento de cromatina tumoral
• Metilação aberrante (5-metilcitosina): ctDNA tumor-específico tem padrões de metilação distintos do cfDNA normal → usados para detecção multi-cancer (Galleri® GRAIL, Oxford Nanopore methylation sequencing)

Tecnologias de Detecção

ddPCR (Digital Droplet PCR)

O ddPCR particiona a amostra em 20.000 gotículas de ~1 nL cada → cada gotícula contém 0 ou 1 cópia de DNA → PCR em paralelo em cada gotícula → contagem de gotículas positivas/negativas → quantificação absoluta sem curva padrão. Limite de detecção: 0,001-0,01% de frequência alélica variante (VAF). Ideal para monitorar variantes conhecidas (mutações específicas de resistência como EGFR T790M, PIK3CA H1047R, KRAS G12D) em amostras seriadas.

NGS de ctDNA (Sequenciamento de Nova Geração)

O NGS permite sequenciamento massivamente paralelo para detectar múltiplas variantes simultaneamente — painéis de 73-523 genes (Guardant360, FoundationOne Liquid CDx) ou sequenciamento de genoma completo em baixa cobertura (shallow WGS, 0.1-0.5×) para detectar CNVs (amplificações, deleções) no ctDNA.

Abordagens de redução de erro:

• UMI (Unique Molecular Identifiers): Tags de DNA de sequência única (6-12 pb) ligados a cada fragmento original antes de amplificação → agrupa reads de mesmo fragmento original → elimina erros de PCR e sequenciamento (consensus reads). Reduz erro de sequenciamento de ~0,1% para < 0,001%
• Duplex sequencing: Sequencia ambas as fitas do dsDNA original → apenas variantes presentes em ambas as fitas são "verdadeiras" → erro de sequenciamento < 0,0001%
• Enriquecimento por hibridização (Capture-based): Sondas biotiniladas de RNA complementares às regiões-alvo → hibridização com biblioteca → captura por streptavidina → sequenciamento das regiões de interesse (vs. amplicon-based que tem menor uniformidade)

CellSearch e CTCs

O CellSearch (Menarini/Veridex, FDA-clearado 2004 para câncer de mama, colorretal e próstata) detecta CTCs por imunomagnetismo: anticorpos anti-EpCAM (epithelial cell adhesion molecule) conjugados a microesferas magnéticas → captura de células EpCAM+ → identificação por IF com DAPI (núcleo), anti-CK (citoqueratina 8/18/19, epitelial) e anti-CD45 (leucócito, negativo). Contagem de CTCs ≥ 5/7,5 mL em mama e CRC correlaciona com pior OS em estudos prospectivos validados.

Aplicações Clínicas Aprovadas

Guardant360® (Guardant Health)

Painel de ctDNA de 74 genes (SNVs, indels, CNVs, fusões) aprovado FDA 2020 para seleção de terapia em tumores sólidos com progressão. Sensibilidade para detecção de variantes clinicamente acionáveis em ctDNA vs. biópsia tecidual: concordância ~75-85% para as variantes mais frequentes.

Guardant Reveal®: Detecção de doença residual mínima (MRD) em CCR: sensibilidade para MRD pós-cirúrgico (ctDNA+ em 4 semanas pós-ressecção) prediz recorrência em 90% dos casos com HR 7,2. Não aprovado mas usado em pesquisa.

FoundationOne® Liquid CDx

Painel de 324 genes em ctDNA, aprovado FDA 2020. Aprovação complementar: identificação de pacientes elegíveis para pembrolizumabe (MSI-H), rucaparibe (BRCA1/2), alpelisibe (PIK3CA), osimertinibe (EGFR ex19del/L858R), selpercatinibe (RET), entre outros — aprovações companion diagnostic.

GRAIL Galleri®

Teste multi-cancer early detection (MCED) — detecta metilação tumoral em cfDNA via target bisulfite sequencing de 100.000+ regiões CpG → algoritmo ML classifica como "cancer signal detected" e prevê tissue of origin. NHS-Galleri Trial (UK, N=140.000): sensibilidade para detectar cânceres estágio I-III em rastreamento de rotina em avaliação.

Biomarcadores Peptídicos/Proteicos Circulantes

PSA (Antígeno Prostático Específico)

Proteína de 28,7 kDa (glicoproteína), serina protease da família das calicreínas (KLK3), secretada por células epiteliais da próstata — normalmente lacrada na barreira epitélio-lúmen; escapa para circulação em hipertrofia prostática benigna (HBP), inflamação e câncer. PSA total < 4 ng/mL (normal), 4-10 (zona cinza), > 10 (alto risco). PSA livre/total < 0,10 correlaciona com câncer (vs. HPB).

PSA como surrogate endpoint nos ensaios clínicos de CRPC (câncer de próstata resistente à castração) — PSA50 (≥50% redução) é biomarcador de resposta reconhecido pela FDA; PSA90 melhor correlato de OS em análises post-hoc.

PSA velocity (PSAV) e PSA doubling time (PSADT): PSADT < 3 meses em recorrência bioquímica após prostatectomia radical correlaciona com maior risco de metástase e morte por câncer de próstata.

CA-125 e HE4 (Ovário)

CA-125 (cancer antigen 125, MUC16): Mucina de alta MW (200-1000 kDa); elevada em 80% dos carcinomas epiteliais de ovário (CEO) avançados; 50% dos estágio I. Usado no monitoramento de resposta a quimioterapia (platina + taxano) — declínio ≥ 50% = resposta parcial. ROMA score (CA-125 + HE4 + menopausa) para triagem pré-cirúrgica de massas pélvicas.

HE4 (human epididymis protein 4, WFDC2): Proteína de 25 kDa, elevada em CEO (especialmente células claras e endometrioides) e algumas CEV endometrial; menor elevação em cistos benignos vs. CA-125.

Outros Biomarcadores Peptídicos em Oncologia

• AFP (alfafetoproteína): Glicoproteína oncofetal de 70 kDa; elevada em HCC (hepatocarcinoma, > 400 ng/mL), tumor de células germinativas (não-seminoma), hepatoblastoma
• β-hCG: Subunidade beta da gonadotrofina coriônica humana; elevada em coriocarcinoma, células germinativas mistas; monitoramento pós-quimioterapia em TGM
• Cromogranina A: Proteína ácida de 49 kDa, co-secretada por células neuroendócrinas; elevada em NET (tumor neuroendócrino) gastro-entero-pancreático
• Pro-GRP (pro-Gastrin-Releasing Peptide): Precursor de GRP/bombesina; marcador de CPPC (carcinoma pulmonar de pequenas células) com especificidade superior a NSE
• Calcitonina: Peptídeo de 32 aa do paratireóide C; elevada em carcinoma medular da tireoide (CMT) → screening familiar em SDM2A/MEN2B

Doença Residual Mínima (MRD) como Endpoint

O uso de ctDNA para MRD pós-tratamento está em avaliação em múltiplos contextos:

• CCR adjuvante (DYNAMIC trial, NEJM 2022): ctDNA-guided adjuvant chemotherapy vs. padrão → ctDNA-guiado reduziu uso de quimioterapia em 50% sem impacto em RFS — prova de conceito de desescalonamento baseado em ctDNA
• NSCLC ressecado (IMvigor011 e outros): ctDNA+ pós-lobectomia → ativação de adjuvância (atezolizumabe) vs. observação em estágio IB-IIIA; resultados em andamento
• Mama HER2- (ZEST trial): ctDNA+ 12 semanas pós-neoadjuvância → randomização para capivasertib (AKT inibi) vs. placebo como intensificação de adjuvância

Referências Científicas

1. Siravegna G et al. Integrating liquid biopsies into the management of cancer. *Nat Rev Clin Oncol*. 2017;14(9):531-548. PMID: 28252003
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3. Cristofanilli M et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. *NEJM*. 2004;351(8):781-791. PMID: 15317891
4. Tie J et al. (DYNAMIC). Circulating tumor DNA analysis guiding adjuvant therapy in stage II colon cancer. *NEJM*. 2022;386(24):2261-2272. PMID: 35665774
5. Klein EA et al. (GRAIL). Clinical validation of a targeted methylation-based multi-cancer early detection test using an independent validation set. *Ann Oncol*. 2021;32(9):1167-1177. PMID: 34176681
6. Oxnard GR et al. Association between plasma genotyping and outcomes of treatment with osimertinibe (AZD9291) in advanced non–small-cell lung cancer. *J Clin Oncol*. 2016;34(28):3375-3382. PMID: 27354477
7. Parikh AR et al. Liquid versus tissue biopsy for detecting acquired resistance and tumor heterogeneity in gastrointestinal cancers. *Nat Med*. 2019;25(9):1415-1421. PMID: 31427797
8. Murtaza M et al. Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA. *Nature*. 2013;497(7447):108-112. PMID: 23563269