Peptídeos e Epigenômica: CRISPR, Histonas, Metilação de DNA, MicroRNA e Terapia Gênica

Epigenética — Regulação Além do DNA

Epigenética (estudo de mudanças hereditárias na expressão gênica sem alteração da sequência de DNA; herança mitótica e às vezes meiótica):

4 mecanismos epigenéticos principais:

1. Metilação de DNA (CpG → 5-metilcitosina; silenciamento gênico)
2. Modificações pós-traducionais de histonas (acetilação, metilação, fosforilação, ubiquitinação)
3. Remodelação de cromatina (complexos SWI/SNF, NuRD; dependentes de ATP)
4. RNA não-codificante (miRNA, lncRNA, piRNA; regulação pós-transcricional + cromatina)

Cromatina (DNA + proteínas; 2 m de DNA em núcleo de 6 µm):

• Nucleossomo: 146 pb de DNA enroladas 1,7× ao redor do octâmero de histonas (2×H2A + 2×H2B + 2×H3 + 2×H4); H1 conecta (linker histone)
• Eucromatina (aberta; H3K27ac + H3K4me3; genes ativos): transcripcionalmente ativa
• Heterocromatina (compacta; H3K9me3 + H3K27me3; genes silenciados): inacessível à RNA Pol II

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Histonas — Peptídeos de Compactação do DNA

Estrutura e Função das Histonas

Histonas (proteínas básicas ricas em Lys/Arg; carga positiva interage com DNA carregado negativamente):

• H1 (~20-23 kDa; linker histone; não faz parte do octâmero; conecta nucleossomas)
• H2A (~14 kDa; 130 aa; 7 variantes: H2A.X, H2A.Z, macroH2A, etc.)
• H2B (~14 kDa; 125 aa)
• H3 (~15 kDa; 135 aa; mais modificada; variantes: H3.1, H3.2, H3.3, CENP-A)
• H4 (~11 kDa; 102 aa; muito conservada ao longo da evolução — idêntica em humanos e ervilha!)

Caudas N-terminais das histonas (10-40 aa; protruem do nucleossomo; sujeitas a modificações PTM):

• H3: Met1-Ala31 (rica em Lys4, Lys9, Lys14, Lys18, Lys23, Lys27, Arg2, Arg8; e Ser10, Ser28)
• H4: Met1-Lys20 (Lys5, Lys8, Lys12, Lys16, Lys20 = sítios de acetilação e metilação)

Modificações de Histonas

"Código de histonas" (hipótese Strahl & Allis 2000): combinação de modificações → recrutamento de efetores → regulação):

| Modificação | Resíduo exemplo | Enzima "escritora" | Enzima "apagadora" | Significado | |---|---|---|---|---| | Acetilação | H3K27ac; H3K4ac | HAT (KAT; CBP/p300; PCAF; Gcn5) | HDAC (1-11; SIR2 = SIRT1-7) | Eucromatina ativa; enhancers | | Metilação | H3K4me3 (ativa); H3K27me3 (silencia) | HMT (KMT; EZH2; MLL1; SETD2) | KDM (LSD1/KDM1A; JMJD2) | Promotores ativos / silenciamento PRC2 | | Fosforilação | H3S10ph; H2A.XS139ph (γH2A.X) | Aurora B; ATM/ATR | PP1; PP2A | Mitose (H3S10ph) + DSB (γH2A.X) | | Ubiquitinação | H2AK119ub1 (silencia); H2BK120ub1 (ativa) | PRC1 (Ring1A/B); RNF20/40 | USP16; USP22 | Silenciamento PRC1 (H2A); transcrição ativa (H2B) |

EZH2 (Enhancer of Zeste Homolog 2; subunidade catalítica do PRC2; HMT; H3K27me3):

• PRC2 (Polycomb Repressive Complex 2; EZH2 + EED + SUZ12): trimetila H3K27 → heterocromatina repressiva
• EZH2 mutações gain-of-function: linfomas foliculares (Y641; hipermetilação H3K27me3 → supressores tumorais silenciados)
• Inibidores de EZH2: tazemetostat (Tazverik®; FDA 2020; epitelioid sarcoma; linfoma folicular EZH2+)

Metilação de DNA — O Silenciador Fundamental

DNA Metiltransferases (DNMTs)

Metilação de CpG (5-metilcitosina; marca epigenética mais estudada; ~75% dos CpGs no genoma humano são metilados; ilhas CpG em promotores geralmente hipometiladas):

• DNMT1 (mantenedor; prefere hemi-metilado; copia padrão durante replicação; associada a PCNA)
• DNMT3A + DNMT3B (de novo methyltransferases; estabelecem novo padrão durante desenvolvimento + diferenciação + carcinogênese)
• TET1/2/3 (dioxigenases; oxidam 5mC → 5hmC → 5fC → 5caC → desmetilação ativa)

Metilação em câncer:

• Hipermetilação de ilhas CpG de supressores tumorais: CDKN2A (p16), MLH1, BRCA1, VHL → silenciamento → progressão tumoral
• Hipometilação global: instabilidade genômica; retroelementos ativados; prometilação de oncogenes
• Oncometabólito IDH1/2 mutante: R132H-IDH1 (glioma) → acumula 2-HG (2-hidróxi-glutarato) → inibe TET2 + KDM → hipometilação + hipermetilação aberrante → "glioma CpG island methylator phenotype (GIMP)"

CRISPR-Cas9 — Edição Gênica Mediada por Peptídeo

O Sistema CRISPR-Cas9

CRISPR-Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats — Cas9; sistema de imunidade bacteriana adaptado para edição gênica; Nobel Química 2020 para Jennifer Doudna + Emmanuelle Charpentier):

• Cas9 (CRISPR-associated protein 9; nuclease de DNA de dupla fita; 1368 aa em SpCas9 de Streptococcus pyogenes; 160 kDa):

- Domínio RuvC + domínio HNH: cada um cliva uma fita → DSB (Double Strand Break) no locus alvo - Guiado por sgRNA (single guide RNA; ~100 nt; fusão do crRNA + tracrRNA) → complementaridade ao DNA alvo + reconhecimento do PAM (Protospacer Adjacent Motif; 5'-NGG-3' para SpCas9)

Mecanismo:

1. sgRNA se liga ao domínio bridge helix de Cas9 → mudança conformacional de inativo para ativo
2. sgRNA/Cas9 escaneia DNA → PAM 5'-NGG encontrado → Cas9 "abre" o DNA
3. Complementaridade do sgRNA com fita-não-PAM → deslocamento de R-loop → HNH cliva fita complementar + RuvC cliva fita-PAM → DSB a 3 pb antes do PAM
4. DSB → reparo celular: NHEJ (Non-Homologous End Joining; indels → KO) ou HDR (Homology-Directed Repair; template inserido → knock-in)

Variantes de Cas9 para aplicações específicas:

• dCas9 (dead; sem atividade de nuclease; dirige outros efetores ao locus):

- CRISPRi: dCas9-KRAB (repressor) → silencia gene alvo - CRISPRa: dCas9-VP64 (ativador) → ativa gene alvo

• Base Editors (CBE, ABE): Cas9 nickase + deaminase → converte C→T ou A→G sem DSB
• Prime Editors: Cas9 nickase + reverse transcriptase + pegRNA → edição versátil (inserções, deleções, substituições) sem DSB

Terapia Gênica com CRISPR

Aprovações CRISPR (2023):

• Exagamglogene autotemcel (exa-cel; Casgevy®; Vertex/CRISPR Therapeutics; FDA dezembro 2023):

- Indicação: células-tronco hematopoéticas do paciente editadas ex vivo → BCL11A enhancer deletado → HbF ↑ → substitui HbS - Sickle cell disease + β-talassemia transfusão-dependente

MicroRNAs — Reguladores Pós-Transcricionais

MicroRNAs (miRNA; ~22 nt; RNA não-codificante; pós-transcrição; ~2.000 miRNAs humanos anotados; regulam >50% dos genes):

1. Biogênese: gene de miRNA → pri-miRNA (transcrito por Pol II) → Drosha/DGCR8 (núcleo) → pre-miRNA (~70 nt hairpin) → exportado por Exportina-5 → Dicer (citoplasmático) → duplex ~22 pb → RISC carrega a fita guia
2. Mecanismo de silenciamento: miRNA-RISC → complementaridade com 3'UTR do mRNA alvo → (a) repressão translacional (complementaridade parcial, comum em animais) ou (b) clivagem de mRNA (complementaridade perfeita, como em plantas)

miRNAs clinicamente relevantes:

• miR-21 (oncomiRNA; overexpresso em múltiplos cânceres; alvo: PTEN, PDCD4, RECK, FasL → ↓apoptose + ↑invasão)
• miR-122 (específico do fígado; 72% dos miRNAs hepáticos; alvo: ciclo celular hepático; biomarcador de hepatotoxicidade)
• let-7 (tumour supressor; alvos: RAS, HMGA, LIN28; downregulado em cânceres; LIN28 inibe let-7 para manter pluripotência)
• miR-155 (oncomiRNA; também imunomodulador; overexpresso em DLBCL, LLC; alvo: SHIP1, SOCS1 → inflamação ↑)

Terapia Gênica — Vetores Proteicos e Lipídicos

AAV — Adeno-Associated Virus

AAV (Adeno-Associated Virus; vírus de DNA de fita simples; ~4,7 kb capacidade; não-patogênico; imunogenicidade moderada; FDA-aprovado como vetor):

• Capsídeo proteico (VP1, VP2, VP3; 87, 73, 62 kDa; 60 subunidades; icosaédrico; sorotipo determina tropismo):

- AAV9: SNC, coração, músculo esquelético (cruza BHE via FcRn e outras) - AAV8: fígado (muito eficiente) - AAV2: olho (retina)

Aprovações AAV:

• Voretigeno neparvovec (Luxturna®; Spark/Roche; FDA 2017; AAV2-RPE65; amaurose congênita de Leber; injeção subretiniana)
• Onasemnogene abeparvovec (Zolgensma®; AveXis/Novartis; FDA 2019; AAV9-SMN1; SMA tipo 1; mais cara do mundo; dose única IV)
• Valoctocogene roxaparvovec (Roctavian®; BioMarin; FDA 2023; AAV5-FVIII; hemofilia A grave)

LNP-mRNA — O Vetor das Vacinas COVID-19

Nanopartículas Lipídicas (LNP) + mRNA modificado (ψ-Uridina → 1-methylpseudouridine; Karikó/Weissman Nobel 2023):

• mRNA-1273 (Moderna): spike SARS-CoV-2 mRNA + SM-102 LNP
• BNT162b2 (Pfizer/BioNTech): spike mRNA + ALC-0315 LNP
• Biodistribuição: LNPs concentradas no fígado + músculo (injeção IM) + baço + outros

siRNA LNP hepático (inclisiran; Leqvio®; Alnylam/Novartis; FDA 2021): GalNAc conjugado → ASGR hepático → silencia PCSK9 → ↓LDL

Referências Científicas

1. Allis CD & Jenuwein T (código de histonas; HAT HDAC; HMT KDM; H3K27me3 EZH2 PRC2; H3K4me3 ativo; epigenética revisão seminal). *Nat Rev Genet* 2016;17(8):487–507.
2. Doudna JA & Charpentier E (CRISPR-Cas9; sgRNA; DSB; NHEJ HDR; base editors prime editors; Nobel 2020; revisão seminal). *Science* 2012;336(6096):816–821.
3. Jones PA & Baylin SB (metilação DNA CpG DNMT1 DNMT3; TET5mC; hipermetilação supressores tumorais; IDH2-HG; câncer epigenética; revisão). *Cell* 2007;128(4):683–692.
4. Bartel DP (microRNA; biogênese Drosha Dicer RISC; 3'UTR silenciamento; miR-21 oncomiRNA; let-7 tumour suppressor; miR-122 fígado; revisão). *Cell* 2009;136(2):215–233.
5. Mendell JR et al. (Zolgensma onasemnogene AAV9-SMN1; SMA tipo 1; FDA 2019; dose única IV; ERT comparação; revisão terapia gênica SMA). *N Engl J Med* 2017;377(18):1713–1722.
6. Karikó K et al. (mRNA modificado pseudouridina; LNP BNT162b2 mRNA-1273; vacinas COVID-19; Nobel 2023; transfecção eficiente; resposta imune reduzida). *Immunity* 2005;23(2):165–175.

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