RNA Splicing: Da Pre-mRNA ao mRNA Maduro
As Sequências Consenso do Splicing
Elementos Chave em Cada Íntron: ``` 5' SS: ...Exon|GURAGU. (GU Quase Invariante → 5' Splice Donor) BP: YNYURAY (Y=Pyr, R=Pur, N=Any) → A Conservada para a Reação PPT: Polipyrimidina Tract (CU-Rich, ~18-40nt Upstream de 3' SS) 3' SS: ...YYYYYYYYYYYYNCAG|Exon. (AG Quase Invariante → 3' Splice Acceptor) ```
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O Spliceosome: A Máquina de Splicing
Montagem Sequencial: ``` U1 snRNP → Base-Pair com 5' SS (E Complex) U2 snRNP → Base-Pair com BP (A Complex, com BB Bridging via U2AF) U4/U6-U5 tri-snRNP → Incorpora (B Complex) Rearranjos Conformacionais (DEAD-Box Helicases: Brr2, Prp2, Prp16, Prp22) → B* (Ativado) → C Complex (1ª Transesterificação) → C* (2ª) → P Complex ```
As 2 Transesterificações de Splicing: ``` 1ª: 2'-OH da Adenosina do BP Ataca 5' SS Fosfodiéster → 5' Exon Liberado + Lariat Intermediário Formado (2'-5' Ligação)
2ª: 3'-OH do 5' Exon Liberado Ataca 3' SS → Exons Unidos (Exon-Exon Junction Complexo Formado) + Lariat (Contendo o Íntron) Liberado → Debranching (DBR1) → Degradação ```
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Splicing Alternativo: Diversidade a Partir de um Gene
Tipos e Frequências: ``` Exon Skipping (60-65%): Exon Omitido → Isoforma Mais Curta ou Frameshift Intron Retention (5-10%): Íntron Mantido → NMD ou Proteína Anormal Alt 5' SS (18%): Exon Maior ou Menor Alt 3' SS (17%): Similar Mutually Exclusive (5%): Ex. α-Tropomiosina, Fast vs. Slow Muscle ```
Reguladores: ``` SR Proteins (SRSF1/2/3...): Ligam ESEs → PROMOVEM Inclusão hnRNP Proteins (A1, C1/C2): Ligam ESSes/ISSes → INIBEM Inclusão
Balanço SR/hnRNP = Decisão de Splicing ```
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SMA: O Paradigma das Terapias de Splicing
O Problema de Splicing em SMN2: ``` SMN1 → Éxon 7 SEMPRE Incluído → SMN Proteína Funcional Completa SMN2 → C6T Transição em Éxon 7: Destrói ESE (Não Liga SRSF1/Tra2β) Cria Binding Site para hnRNP A1 (ISS-N1) → INIBE Inclusão do Éxon 7 → 85-90% Skipping do Éxon 7 → SMN Truncado (Sem Éxon 7) = Não Funcional SMA: Perda de SMN1 → Apenas SMN2 Residual → Pouco SMN → Neurônios Motores Morrem ```
Nusinersena (Spinraza®) — Estratégia de ASO: ``` ASO (2'-Methoxyethyl Fosfotioato = MOE, Resistente a Nucleases) → Complementar ao ISS-N1 em Íntron 7 de SMN2 → Bloqueia Fisicamente hnRNP A1 de se Ligar ao ISS-N1 → hnRNP A1 Não Inibe → Éxon 7 de SMN2 Incluído (~50-75%) → Mais SMN Proteína Funcional → Neurônios Motores Sobrevivem ```
Resultados (ENDEAR Trial):
- SMA Tipo 1 Infantil (Diagnóstico < 6m)
- Motor Milestones: 41% Nusinersena vs. 0% Placebo
- Menos Mortes e Necessidade de Ventilação
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Exon Skipping em DMD
Raciocínio para Skip de Éxon: ``` DMD: Mutação Frameshift → Stop Prematuro → Sem Distrofina → Grave Becker: Deleção In-Frame → Distrofina Truncada → Menos Grave
Estratégia ASO: Pular Éxon Adjacente → Restaurar Frame Ex: Deleção Exon 50 (Frameshift) + ASO Skip Exon 51 → In-Frame Deleção → Distrofina Truncada (Como Becker) → Menos Grave ```
Aprovados (Sarepta): Eteplirsen (Ex51) + Golodirsen (Ex53) + Viltolarsen (Ex53) + Casimersen (Ex45)
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Referências
- Will CL, Lührmann R. "Spliceosome structure and function." *Cold Spring Harb Perspect Biol.* 2011;3(7):a003707.
- Graveley BR. "Alternative splicing: increasing diversity in the proteomic world." *Trends Genet.* 2001;17(2):100–107.
- Hua Y, et al. "Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model." *Genes Dev.* 2010;24(15):1634–1644.
- Finkel RS, et al. "Nusinersen versus sham control in infantile-onset spinal muscular atrophy." *N Engl J Med.* 2017;377(18):1723–1732.
- Cirak S, et al. "Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment." *Lancet.* 2011;378(9791):595–605.
- Scotti MM, Swanson MS. "RNA mis-splicing in disease." *Nat Rev Genet.* 2016;17(1):19–32.